脊髓性肌萎（wěi）缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常染色体（tǐ）隐（yǐn）性遗传（chuán）病（bìng），居儿童致死性（xìng）常（cháng）染色体隐性遗（yí）传病的（de）第2位。位于染色体5q11.2～q13.3上（shàng）的运动神经元存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致（zhì）病基因。

　　人（rén）基因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和着丝（sī）粒侧（cè）的SMN2，两者仅有5个碱（jiǎn）基不同（tóng）。SMN1是主要功能基因，该基因突变可导致SMA发病，SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严（yán）重程度（dù），其拷贝（bèi）数（shù）增（zēng）加可减（jiǎn）轻SMA表型。目前已知（zhī）约94％的SMA患者为SMN1基因第7和（或）第8外显子纯合缺失所（suǒ）致，少数病例（lì）可由SMN1基因点突（tū）变或小的缺（quē）失引起。

　　SMN1基因外显子缺失检（jiǎn）测的意义

　　SMA在人（rén）群中的发（fā）病（bìng）率为1/5000～1/10000，群（qún）体携带者频率为（wéi）1/35～1/50，是出生缺陷的高危因素，因此极有必要（yào）进行SMA携（xié）带者（zhě）的人群筛（shāi）查（chá），并通过产前诊断技术降低人群中SMA患儿的出生率（lǜ）。

　　临床上将SMA分为（wéi）Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中间型和少年型，严重程度依次（cì）递（dì）减。神经专科医生一般（bān）根（gēn）据患者（zhě）发病年龄、临（lín）床表现及病（bìng）情（qíng）进展程度进行临床诊断，辅助检查方法包括肌电（diàn）图（tú）、肌（jī）酶和肌肉（ròu）活检，结合家（jiā）族史和SMN1基因分析可进（jìn）行确诊。由（yóu）于SMA患儿（ér）中（zhōng）约94%为SMN1基因（yīn）外显（xiǎn）子纯（chún）合缺失，因此，SMN1基因缺失检测对（duì）于SMA的诊断具有更高的灵敏度和特异性。且对不同（tóng）型的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差异，所以，SMN1纯合缺失的检测对于不同型（xíng）SMA患者具有相（xiàng）同（tóng）的临床诊断价值。在欧美人群（qún）中，SMN1基因纯合缺失检测（cè）已成为诊断和排除诊断（duàn）SMA的首选方法（fǎ）。

　　SMN1基因缺失检测试剂的现状（zhuàng）

　　目前，SMN1基因外显子（zǐ）缺失检测（cè）试剂较（jiào）为（wéi）缺乏，临床（chuáng）检验实（shí）验室较（jiào）为（wéi）公认的方法是PCR结合限制性（xìng）片段长度多态性（PCR-RFLP）的（de）方法。但该方法操（cāo）作（zuò）较为繁琐（suǒ），且重复性差，不利于标准化（huà），不易推（tuī）广。同时，这（zhè）种方（fāng）法只能检测出纯合缺（quē）失，无（wú）法确认杂合缺（quē）失。

　　荷兰的（de）SMAMLPA检测试剂可对待测靶序列进行半定量分析（xī），因此（cǐ）既可（kě）检测纯合缺失，亦可确（què）认杂合缺失。在国内外已有多篇文（wén）献报道采用该方法进（jìn）行SMA患（huàn）者诊断和SMA携带者（zhě）筛（shāi）查。但（dàn）该产品目前仍为“仅（jǐn）用于研究”的试（shì）剂，尚未按照体外诊断类医疗器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国家食品药品监管总（zǒng）局批准了第一项SMN1缺失突变检测试剂上市。该产品采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针（zhēn）PCR法，以人基因组单拷贝基因RPP40为内（nèi）参（cān）基因，对SMN1基因（yīn）第（dì）7外（wài）显子和（hé）第8外显（xiǎn）子拷贝（bèi）数进行相对（duì）定量检测，用于SMA患者的体外辅助分子诊断。SMN1基因外（wài）显子缺失（shī）检测的难点之一在（zài）于排除高同（tóng）源（yuán）性基因SMN2的干扰，特别（bié）是对于SMN2高拷贝数的受试者，需保证结果的准确可靠。该（gāi）产品通过对实时（shí）荧光PCR相对定量（liàng）、绝对定量技术进行（háng）系统整合，并在反应（yīng）体系中加入（rù）特定化学（xué）组（zǔ）分（fèn），以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的错配（pèi），增加PCR扩（kuò）增的特异（yì）性，从而有（yǒu）效控制SMN2基因非特异（yì）性扩增对（duì）检测（cè）结果的影响，准确（què）检（jiǎn）出高拷贝数（shù）SMN2样本（běn）中SMN1基因第7和第8外显子的缺失情况。

　　鉴于国（guó）内外（wài）尚无任何按照体外（wài）诊断试剂批准上市的（de）SMA分子诊断产品，因此（cǐ）临床试验（yàn）方案中依据EMQN关（guān）于《SMA分子诊断最佳实践（jiàn）指南》，采（cǎi）用了国内（nèi）外SMA体外辅助分子诊断领域公认的（de）PCR-RFLP法（fǎ）作为对（duì）照方法。临床试（shì）验共完成1069例，其中正常对照组777例，SMA病例组292例，统（tǒng）计分析结果显示申报产（chǎn）品（pǐn）与对比方法（fǎ）检测结果的一（yī）致性为100%（95%置（zhì）信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正（zhèng）常（cháng）成年（nián）人大样本中目标（biāo）外显子△△Ct分布范围的（de）调（diào）查（chá）亦显示（shì），该产（chǎn）品的纯合突变判断界值设置合（hé）理。

　　该（gāi）试剂目（mù）前批准的预期用途仅包含纯（chún）合缺失（shī）的检测，尚不能用于（yú）杂合（hé）缺失（shī）的检测（cè），因此无法用于（yú）SMA携（xié）带者的筛查（chá），这是该产品的缺陷之（zhī）一。

　　事（shì）实上，该产品（pǐn）在设计上已考虑到SMA携带（dài）者的检测（cè），其（qí）检测（cè）原理是以待测样本中（zhōng）目标外显子荧光信号Ct值（zhí）与内参基因荧（yíng）光信号（hào）Ct值之差（△Ct_s），与正（zhèng）常（cháng）对照品三个梯度稀（xī）释品中目标外显子（zǐ）荧光信号Ct值（zhí）和内（nèi）参基（jī）因荧（yíng）光信号Ct值之差的平（píng）均值（△Ct_a）之（zhī）差，即△△Ct，作为待测样本中（zhōng）目标外显子拷贝数检（jiǎn）测变（biàn）量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时荧光定量PCR相对定量的基本数学原（yuán）理推导得到申（shēn）报产品检（jiǎn）测变（biàn）量△△Ct的计（jì）算公式，依据（jù）这（zhè）一计（jì）算公式可推导出纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct理（lǐ）论值（或（huò）范围）；再结（jié）合目标外显子与内参基（jī）因扩增效率差（chà）异以及SMN2不同（tóng）拷（kǎo）贝数的（de）影响，可对上述（shù）△△Ct理论值进行优化。结果（guǒ）显示（shì）纯（chún）合（hé）缺失、杂合（hé）缺（quē）失和野生型的△△Ct值（或范围）之间可设置合理的判断界值，因此理论上该产品可分别检测出三种（zhǒng）基因状态（tài）。但（dàn）鉴（jiàn）于生产企业（yè）对杂合缺失（shī）与野（yě）生（shēng）型之间（jiān）的（de）判断界值研究尚不透彻，再加上缺乏可（kě）判定杂（zá）合（hé）缺失的（de）对比方法等其他困难，本次注册申请的预期用途仅限于（yú）检测（cè）纯合突变，即SMA患者辅助诊断。

　　综上，SMN1基因外显子缺失检测在SMA疾病诊断和SMA携带者筛（shāi）查中具有（yǒu）重要（yào）的临床价值。然而到（dào）目前为止，受（shòu）到技术水平的限（xiàn）制，相关（guān）的体（tǐ）外诊断试（shì）剂（jì）比较缺乏，特别是可用于（yú）SMA携带者（zhě）筛查（chá）的杂合缺失检测，尚（shàng）无（wú）适合的体外诊断试剂上市。（器（qì）审中心审（shěn）评（píng）六部  何静云（yún））

来源：中国（guó）医药（yào）报